人参皂甙Rg1对脊髓神经元细胞增殖的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.07.004

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (7): 1003-1007.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.07.004

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人参皂甙Rg1对脊髓神经元细胞增殖的影响

孙建忠¹，刘欣伟²，管华鹏¹，张鹏¹，刘琦¹，杨珺¹，郭群峰¹，倪斌¹

¹解放军第二军医大学长征医院骨科，上海市 200003； ²解放军沈阳军区总医院骨科，全军重症战创伤救治中心，辽宁省沈阳市 110016

出版日期:2015-02-12 发布日期:2015-02-12
通讯作者: 倪斌，教授，主任医师，博士生导师，解放军第二军医大学长征医院骨科，上海市 200003
作者简介:孙建忠，男，1981年生，山东省鄄城县人，汉族，解放军第二军医大学在职博士，主治医师，主要从事脊柱外科临床及实验研究。
基金资助:
上海市宝山区卫生青年医学人才培养计划资助(bswsyq-2014-A03)

Ginsenoside Rg1 effect on proliferation of spinal neurons

Sun Jian-zhong¹, Liu Xin-wei², Guan Hua-peng¹, Zhang Peng¹, Liu Qi¹, Yang Jun¹, Guo Qun-feng¹, Ni Bin¹

¹Department of Orthopedics, Changzheng Hospital, the Second Military Medical University of PLA, Shanghai 200003, China; ²Department of Orthopedics, General Hospital of Shenyang Military Area Command of Chinese PLA, Rescue Center of Severe Wound and Trauma of Chinese PLA, Shenyang 110016, Liaoning Province, China

Online:2015-02-12 Published:2015-02-12
Contact: Ni Bin, Professor, Chief physician, Doctoral supervisor, Department of Orthopedics, Changzheng Hospital, the Second Military Medical University of PLA, Shanghai 200003, China
About author:Sun Jian-zhong, Studying for doctorate, Attending physician, Department of Orthopedics, Changzheng Hospital, the Second Military Medical University of PLA, Shanghai 200003, China
Supported by:
the Young Medical Training Program of Baoshan District in Shanghai, No. bswsyq-2014-A03

摘要/Abstract

摘要：

背景：不同的神经受体通过不同的受体介导产生各自的生物功能，脊髓损伤的根本原因是神经元的死亡和突触的功能丧失，人身皂苷Rg1对神经元细胞可能具有保护作用。

目的：验证人身皂苷Rg1对SD大鼠脊髓神经元细胞的营养保护作用。

方法：对孕龄16日的胚鼠进行脊髓神经元细胞分离提取，对神经元细胞进行冻存和复苏。实验分为3组：空白组、人参皂苷Rg1干预组、阳性对照组(培养孔内加入苯酚溶液)。采用MTT法检测细胞内线粒体的活性及人参皂甙Rg1对神经元细胞的增殖作用。

结果与结论：人参皂苷Rg1干预组细胞吸光度显著高于空白对照组细胞，人参皂苷Rg1干预组细胞的相对活力高于空白组，说明人参皂苷Rg1对神经元细胞具有促进生长的作用。人参皂苷Rg1干预后，细胞的突起增长速度明显快于空白组的细胞，说明人参皂苷Rg1对脊髓神经元细胞具有保护作用，可抑制神经元细胞凋亡，使细胞活力增强。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 人参皂苷Rg1, 脊髓神经元, 细胞增殖

Abstract:

BACKGROUND: Different neuroreceptors medicated by different receptors produce their own biological functions. The root cause of spinal cord injury is the death of neurons and the synaptic dysfunction. Ginsenoside Rg1 may play a protective role in neurons.

OBJECTIVE: To verify the nutritional and protective roles of ginsenoside Rg1 in spinal neurons of Sprague-Dawley rats.

METHODS: The spinal neurons were isolated from embryonic rats at a gestation age of 16 days, and following cryopreservation and resuscitation, the cells were divided into three groups: blank group, ginsenoside Rg1 group and positive control group (phenol solution). MTT method was used to detect the activity of mitochondria and ginsenoside Rg1 effects on the neuronal proliferation.

RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the blank group, the cell absorbance value and cell relative activity were both higher in the ginsenoside Rg1 group, indicating that ginsenoside Rg1 can encourage the growth of neurons. When cells were intervened by ginsenoside Rg1, cell processes grew faster than those in the blank group, indicating ginsenoside Rg1 can protect the neurons, inhibit neuronal apoptosis, and boost the cell vitality.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: Saponins, Neurons, Spinal Cord, Cell Proliferation

中图分类号:

R318

孙建忠，刘欣伟，管华鹏，张鹏，刘琦，杨珺，郭群峰，倪斌. 人参皂甙Rg1对脊髓神经元细胞增殖的影响[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(7): 1003-1007.

Sun Jian-zhong,Liu Xin-wei, Guan Hua-peng, Zhang Peng, Liu Qi, Yang Jun, Guo Qun-feng, Ni Bin. Ginsenoside Rg1 effect on proliferation of spinal neurons[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(7): 1003-1007.

图/表（结果） 5

2.1 神经元细胞的形态观察结果原代培养的神经元细胞在刚刚转移到培养皿中培养时，细胞外形成圆形，在圆形外侧有环形光圈，细胞呈分散分布。

当神经元细胞接种后放在培养箱中培养24 h后，大多数的神经细胞附着在培养皿底部贴壁生长，并且贴壁细胞相互聚集生长，细胞的胞体比较饱满，具有很强的折光性，少数细胞未贴壁生长并且悬浮生长的细胞死亡成为细胞碎片。

当细胞培养至第3天时，能够见到贴壁细胞的外侧产生少量的突起神经元，随着细胞培养时间的延长，细胞的形态也变得多样化，包括圆形、多边形或者不规则形状，细胞的体积增大，产生的细胞突触变得越来越多，而且这些突起变得更粗更长；神经元细胞的轴突分支较少，并且较细部分神经元相互之间联系形成突触联系，在贴壁细胞中能够见到少量的成纤维细胞和神经胶质细胞。

当细胞培养至第6天时，大多数细胞的胞体比较光滑，并且胞体之间的界限清晰可见，细胞具有很强的立体感，突起增粗，在突起的末端又产生新的分叉，分叉变形，各个细胞的突起分叉交织在一起形成网状。

培养10 d后神经元细胞开始退化，表面形状发生变化，细胞的轮廓变得模糊不清，界限不明显，部分细胞死亡，同时胶质细胞和成纤维细胞的数量的增多，神经元细胞的纯度降低，不能够进行实验。见图1。

2.2 神经元细胞鉴定结果细胞免疫组化染色神经细胞的一个表达特异性抗原神经元特异性烯醇化酶的结果显示，神经细胞及细胞突起染色为棕黄色，显微镜下可以看见神经细胞的胞体呈现不规则形、圆形或是多角形，胞浆非常丰富，细胞的突起多少和长短各有不同，而轴突比较细长；细胞突出之间相互交错形成网状结构，见图2。根据这些染色结果可以确定所提细胞为神经元细胞，在显微镜先随机选出3个视野，对阳性染色细胞进行计数，计数结果显示所体细胞的纯度较高均大于80%。

2.3 细胞冻存与复苏结果成功的对大鼠神经元细胞进行冻存和复苏，可以使实验方便，由于原代细胞提取比较麻烦，以便随时使用细胞时能够获得细胞。

2.4 MTT实验结果实验结果显示空白组细胞在570 nm处的吸光度为0.66，人参皂苷Rg1干预组细胞在570 nm处的吸光度为0.768，阳性对照组细胞570 nm处的吸光度为0.178，人参皂苷干预组细胞吸光度显著高于空白对照组细胞，人参皂苷干预组细胞的相对活力高于空白组，说明人参皂苷Rg1对神经元细胞具有促进生长的作用。当细胞给予人参皂苷Rg1干预后，细胞的突起增长速度明显快于空白组的细胞，说明人参皂苷Rg1对神经元细胞具有保护作用，抑制神经元细胞凋亡，使细胞活力增强，见图3，4，表1。

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引言

脊髓损伤是困扰医学界的一大难题，研究发现，脊髓损伤后损伤处会发生大面积的神经细胞凋亡，由于脊髓损伤主要是继发性损伤所产生，所以抑制继发性损伤对脊髓的伤害是治疗脊髓损伤的主要目的^[1-2]。阻断或者延缓脊髓损伤后神经细胞的凋亡能够减轻脊髓损伤对患者带来痛苦，促进其恢复。

脊髓损伤后会导致一系列的病理学变化，涉及的器官和组织比较多，其中脊髓内的神经元细胞、胶质细胞、灰质、白质、血管、脊髓硬膜、髓鞘和神经纤维等病理性变化^[3-6]。

脊髓损伤后首先神经元发生损伤、功能缺失，轴突断裂以及少量的胶质细胞受到破坏，直接造成脊髓神经的传导功能的缺失，阻碍神经元及神经细胞的再生，造成瘢痕的产生。

脊髓是神经信号传导的重要部分，神经细胞是脊髓功能的重要细胞，在众多细胞中对脊髓的作用非常重要，神经细胞的增殖直接影响脊髓神经信号传导^[7-9]。

神经元是神经系统的基本单位，能够体现神经系统结构和功能。神经元是有很多突起的细胞，主要有细胞突起和细胞体两个部分组成。不同的神经受体通过不同的受体介导产生各自的生物机能，脊髓损伤的根本原因是神经元的死亡和突触的功能丧失^[10-11]。

人参皂苷Rg1是从人参中提取出的一类有效成分，其主要作用：人参皂苷Rg1能够增加胆碱能的系统功能，使脑突触对胆碱的摄入量，从而中枢受体的含量，增加大脑中蛋白质的含量；人参皂苷Rg1能够提高对神经细胞具有保护作用，促进神经元的再生修复，而且能够促进脑神经干细胞的定向分化为神经元和胶质细胞；从而达到了脊髓损伤后对脊髓神经的保护作用^[12-14]；人参皂苷Rg1可能通过机体的抗凋亡和抗氧化作用等机制对机体的神经具有一定的保护作用。所以本实验主要采取人身皂苷Rg1对脊髓神经元细胞给予干预，然后采用MTT法检测细胞内线粒体的活性，来证明人身皂苷Rg1对SD大鼠脊髓神经元细胞的营养保护作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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材料方法

设计：分组对照细胞学实验。

时间及地点：于2013年10月至2014年6月在解放军第二军医大学长海医院中心实验室完成。

材料：

实验动物：选取6-8周鼠龄健康雄性SD大鼠15只，体质量220-240 g，由解放军第二军医大学动物实验中心提供，生产许可证SCXK(沪)X2012-0024。

实验方法：

脊髓神经元细胞分离提取：选取怀孕16日左右的SD大鼠，用体积分数10%的水合氯醛以10 mL/kg的剂量将怀孕大鼠麻醉，用乙醇将孕鼠体表喷施消毒，在无菌的条件下取出胚鼠。

用眼科剪将胚鼠背部剪开，配合手术刀分离出胚鼠脊髓，将胚鼠脊髓剪下放置于预冷的无菌PBS中，借助体视显微镜将脊髓外膜和上面的血管等组织剔除，在少量的PBS中将所取的脊髓组织剪碎成泥状，转入15 mL的离心管中放入离心机上面以1 000 r/min的速度离心5 min，离心后将上清弃掉，加入3 mL的0.25%的胰蛋白酶溶液，在 37 ℃的温度下消化15-20 min，消化完毕后加入事先配制好的含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基中终止消化。

用5 mL的移液器反复吹打胚鼠脊髓组织，将组织吹打成悬液，过200目的细胞筛，过筛后细胞悬液放在37 ℃，体积分数5%的CO₂培养箱中进行培养中进行培养，30 min后取出，吸取未贴壁的细胞悬液，然后进行脊髓神经元细胞计数。

细胞培养使用底部涂有0.1 g/L的多聚赖氨酸的6孔板，以4.0×10⁵个/m的细胞浓度加入到6孔板中，吹打均匀，放置在37 ℃，体积分数5%的CO₂培养箱中进行培养，细胞放入二氧化碳培养箱中6 h后大部分细胞均贴壁变形，换液2次/周，每次换液时先将培养基和Hanks’预热，弃去细胞培养基，用Hanks’液洗2遍，然后加入培养基继续进行培养。

神经元细胞的鉴定：神经元特异性烯醇化酶免疫组织化学检测为鉴别所培养的胚胎脊髓神经元的性质，用神经元特异性烯醇化酶免疫细胞化学染色法区别神经元或神经胶质细胞，并且通过免疫组化染色分析出神经元细胞的纯度。

神经元细胞的冻存：用胰酶将细胞消化下，将细胞悬液转移到离心管中，以1 000 r/min离心5 min，离心后弃上清，加入少量培养基制成细胞悬液，用细胞计数板计数，令细胞浓度达5×10⁹L^-1，离心去上清，吸入离管中，加入适量的冻存液分装入无菌1.8 mL细胞冻存管中，每个细胞冻存管加入1 mL细胞悬液；进行封口，细胞冻存管用棉花包好，然后放入-80 ℃冰箱中，24 h后取出，将细胞转移到液氮罐中以便长期保存。

神经元细胞的复苏：将细胞从液氮中取出，迅速放入水浴锅中，待冻存管中的液体完全融化后放入离心机中以 1 000 r/min的速度离心5 min，离心后取出放入超净工作台中弃上清，然后加入1 mL体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基吹打均匀，转移到一次性细胞培养皿中加入10 mL左右的培养基放入二氧化碳培养箱中培养，每3 d更新1次培养液后再继续培养。

MTT法检测人参皂甙Rg1对神经元细胞的增殖作用：培养第6天的神经元细胞稀释成细胞浓度约2.5×10⁷L^-1，将细胞悬液接种于96孔板，每孔加入200 μL，细胞贴壁后，吸出每孔中的培养液，实验共分为3组：空白对照组、人参皂苷Rg1干预组和阳性对照组，每组6孔。

空白组：在有细胞孔内加新配制的含体积分数10%小牛血清的DMEM培养基，200 μL/孔。

人参皂苷Rg1干预组：分别在有神经元细胞孔内加入含有50 mg/L的人身皂苷Rg1的培养基，每孔加入200 μL。

阳性对照组：在含有细胞的孔内加入6.4 mL/L苯酚溶液200 μL /孔。

72 h后取出96孔板，加入MTT25 μL/孔(终浓度为 1 g/L)，避光孵育4 h，吸出液体，将20%的十二烷基硫酸钠溶于50%的二甲基甲酰胺，96孔板每孔加入100 μL的上述混合液，放入37 ℃，体积分数5%CO₂避光孵育20-24 h然后放入酶联免疫监测仪中震荡10 min，在570 nm处测定各时相点各孔吸光度值(A值)；计算相对存活率，相对存活率=待测样品A值/正常组A值×100%。根据相对存活率均值，按照细胞相对存活率评分标准，对样品细胞作用程度进行评价。

主要观察指标： ①神经元细胞的形态观察。②神经元细胞鉴定结果。③细胞冻存与复苏结果。④MTT实验结果。

统计学分析：采用SPSS 18.0统计软件进行数据处理，结果以x(_)±s表示，并进行组间方差分析。P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

在无任何措施的条件下直接对细胞进行冻存，由于细胞的内外环境的水分会直接变成固体形成冰晶，导致细胞发生机械性损伤、脱水、pH值发生改变、细胞内外渗透压发生变化、蛋白质变性等原因发生死亡^[5-6]。当冻存细胞时应向细胞的培养液中加入保护剂，使细胞内水分的冰点降低，在缓慢降温冻结多过程中，是使细胞内的水分在形成冰晶前就渗透到细胞外面，储存细胞的低温条件下能够减少冰晶的产生，对细胞具有保护作用，以免细胞死亡。

目前二甲亚砜和甘油为常用的保护剂，二甲基亚砜和甘油对细胞无毒性，并且其具有分子量小、溶解度大、易于穿透细胞。

对细胞冻存和复苏需要慢冻快融的原则，即细胞冻存时要用棉花包裹，先放到-80 ℃冰箱中，过夜后再转到液氮中冻存，转移到液氮中可以长期保存使用，这样能够保持细胞的活性，以免直接将细胞放入液氮中导致冻存管爆裂或是由于温差大导致细胞死亡。因细胞在-5-0 ℃时最易受损，细胞在复苏的过程中动作应迅速，使细胞快速通过受损期，这样细胞才能够保持活力，能够进行正常的实验。单复苏细胞时，见细胞从液氮中快速的取出放到37 ℃恒温水浴锅中，这样使细胞快速的通过受损期恢复活性。

目前对天然药物的单体的研究非常多，主要通过筛选出天然药物中的有效成分，从而达到治疗的目的。由于中药中含有大量未知成分，所以单纯的服用导致药效差，其中一些物质对人体会有坏处，所以通过对药物单体的选择，能够成功的提高药效，并且减少对患者的伤害^[15-19]。

有研究表明人参皂苷Rg1可抑制一氧化氮诱导的PC12细胞凋亡，作用机制可能与其稳定神经元细胞线粒体跨膜电位、减少线粒体Cyto-c向细胞浆释放以及抑制Caspase-3的激活作用有关^[20-21]。

环磷腺苷是神经元细胞代谢中若干关键代谢途径的交叉点，是内源性的神经保护剂，有研究表明人参皂苷可明显增加神经元细胞内环磷腺苷含量，从而抑制神经元细胞衰老，促进其增殖^[22]。

本实验人参皂苷Rg1干预组细胞的相对活力高于空白组，说明人参皂苷Rg1对神经元细胞具有促进生长的作用。当神经元细胞给予人参皂苷Rg1干预后，细胞的突起增长速度明显增快，说明人参皂苷Rg1对神经元细胞具有一定的保护作用，抑制神经元细胞的凋亡，使神经元细胞活力增强，增殖速度加快。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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